近期，新加坡国立大学研究团队开发了一种与流式细胞术兼容的检测方法，以效应细胞为中心，用于准确识别和分选共培养物中的功能性杀伤细胞亚群。这种检测方法被命名为 PAINTKiller（“proximity affinity intracellular transfer identifcation of killer cells“，即“杀伤细胞的邻近亲和细胞内转移识别”），它依赖于检测裂解细胞在效应细胞表面（具体来说，在细胞上）“绘制”的细胞内荧光蛋白。

PAINTKiller试验的基本原理

如何在现实生活中识别一个杀手？在法医鉴定中，调查人员检查嫌疑人的衣服，是否有受害者血迹的迹象。以这个为类比，当目标细胞被杀死和裂解，其细胞内内容物将溢出，并“涂绘”在附近的“杀伤”细胞的表面。这需要两个缺失的部分，首先，我们需要一种通用的、高丰度的细胞内分子，最好是荧光（直接可视化）作为目标细胞的“血液”。其次，我们需要在效应细胞上穿上带有粘性的“衣服”，能够在杀死事件中捕获任何溢出的“血液”。  

对于“血液”方面，任何依赖于目标细胞的基因修饰来产生一个共同的细胞内分子的方法都会使分析复杂化；因此，实验选择使用一种可以染色任何目标细胞的胞质染料-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE），这是一种细胞渗透性荧光细胞染色染料。它通过其琥珀酰亚胺基团共价结合到细胞内的赖氨酸残基上，可以稳定地保留在细胞内，具有非常高效的标记能力和无毒性质，被广泛用于各种不同细胞类型的细胞内蛋白标记染料。因此，采用CFSE标记法产生大量的荧光胞内蛋白，即靶细胞的“血液”。

接下来的“衣服”方面，需要使用亲和试剂对效应细胞群进行修饰，以便能够从裂解细胞中捕获CFSE标记的胞内蛋白。为此，我们利用抗荧光素异硫氰酸酯（FITC）抗体来捕获细胞表面的CFSE，利用CFSE和FITC之间的结构相似性，这两者都是非荧光素的衍生物。通过制备了双特异性抗体（抗CD45和抗FITC），它们可以在一端与泛白细胞表面标记物CD45结合，在另一端与CFSE结合(图1a)。一旦被这些双特异性抗体标记，效应细胞群将能够在其细胞表面捕获CFSE修饰的蛋白：效应细胞和靶细胞的共培养杀伤并裂解靶细胞后，CFSE从靶细胞释放，并被效应细胞上的抗CFSE抗体捕获。（图1b）。

这种方法称为杀伤细胞的临近亲和细胞内转移鉴定（PAINTKiller）试验，以强调使用亲和试剂从杀伤细胞附近的裂解靶细胞中捕获细胞内内容物的概念。

          

PAINTKiller试验验证

为了证明PAINTKiller的概念，首先分析了NK-92MI效应细胞对K562靶细胞的杀伤作用。为了生成目标细胞的“血液”，K562细胞与CFSE孵育20 min，结果显示高荧光强度，表明其细胞内蛋白的标记非常有效。同时，用CFSE捕获构建物（双特异性抗cd45抗荧光素）对效应NK-92MI细胞进行修饰。为了进行PAINTKiller实验，制备的效应细胞（NK-92MI）和靶细胞（K562-CFSE）以效应靶细胞（E：T）3：1共培养不同的时间，以研究细胞杀伤的动态。

流式细胞术分析共培养细胞显示，NK细胞和K562细胞通过CFSE信号明显区分(图2a)。在对效应细胞和靶细胞进行门控后，分别观察到它们的荧光分布和数量的明显变化(图2a)。 与对照组相比，NK细胞中最明显的变化是在CFSE通道中获得荧光的群体(图2b)。与CFSE标记的K562细胞共培养1小时至4小时后，该群体的表面CD56表达量逐渐增加，其丰度从~的8%逐渐增加到33%（图2b,c)。伴随着这些CFSE+NK细胞的增加，K562细胞数量减少(图2d,e)。根据PAINTKiller分析的设计原理，CFSE+NK细胞代表杀死一个或多个CFSE标记的靶细胞并捕获受害者释放的CFSE标记蛋白的效应细胞。这些研究结果表明，PAINTKiller试验可以在杀伤试验中提供效应细胞和靶细胞的敏感和定量的单细胞表征，并揭示效应杀伤功能的群体异质性。    

为了进一步描述CFSE+NK细胞，实验用抗cd107a抗体染色。CD107a是一种与脱颗粒相关，经常被用作细胞毒性细胞的代理。由于溶解颗粒的释放被认为是NK细胞溶解的主要机制，实验在NK细胞中观察到CFSE和CD107a 信号之间呈正相关，表明两种方法鉴定的细胞毒性群体之间有相当大的重叠(图3e)。

总之，PAINTKiller显示了其优越性。首先，它是以效应细胞为中心，其次，PAINTKiller能兼容流式细胞仪，因此，它可以很容易地与现有的多参数单细胞分析能力（包括细胞表型标记物和细胞因子分泌分析）相结合，以建立功能细胞毒性与细胞表型的相关性。