实验方法

细胞系与细胞培养 人类胚胎干细胞(hESCs，细胞系：KhES1)和人类诱导多能干细胞(hiPSCs，细胞系：409B7和CB-A11)均来自于日本京都大学。所有干细胞均接种于0.25μg/cm² iMatrix 511包被培养皿中，并用AK02N培养基进行增殖维持。

造血细胞分化

当干细胞克隆生长至直径750~1000μm，培养基被更换为含2μM GSK-3抑制剂CHIR-99021，80ng/mL BMP-4，50ng/mL SCF，80ng/mL VEGF的 Essential 8培养基，培养持续到Day2-4。之后，培养基会被更换为含2 mM ALK5抑制剂SB431542，50ng/mL SCF，50ng/mL FLT3L的 Stem line II培养基，培养至Day12，以进行造血祖细胞(HPCs)诱导。     

NK细胞分化

在Day12，HPCs被接种至含20%人AB血清的DMEM培养基中，或 Stem line II培养基中。所有培养基中添加50ng/SCF, 50ng/mL FLT3L, 50ng/mL IL-7, 50ng/mL IL-15。每四天去除一半的培养基并补充一半新鲜的含因子培养基。直至培养至Day18。

细胞毒性检测

白血病细胞系K562与铬51(⁵¹Cr)在37℃下孵育1h。在与NK细胞共孵育前用PBS清洗3次，K562和NK细胞的孵育在96孔U底培养板中进行，37℃4h。孵育结束后，样本经过离心，上清液加入2%Triton-X 100用 MicroBeta²分析⁵¹Cr释放。      

体内肿瘤模型分析

NOG小鼠接种荧光素酶标记的K562(K562-Lue)，所有小鼠都会在右侧皮下注射1×10⁵个K562-Lue与培养基的混合物，或者注射K562与1×10⁶个hPSCs来源的NK细胞混合后注射。小鼠在注射荧光素以后用 IVIS Bioluminescence Imaging System监测肿瘤生长。          

实验结果

人多能干细胞来源的造血祖细胞诱导

改良后的造血祖细胞诱导方法见下图A。加入GSK-3抑制剂CHIR-99021和ALK5抑制剂SB431542的目的在于增强Wnt/β-catenin信号和抑制TGF-β信号，以增强中胚层的诱导效率。在Day2，95%以上的ESCs或PSCs都转变KDR+的中胚层祖细胞(见下图B)；在Day4时，培养皿中20%以上的细胞为KDR⁺CD34⁺的造血祖细胞(见下图C)。在更换HPCs诱导培养基后，到Day12时，培养皿中CD34⁺CD43⁺CD45⁺的HPCs占比超过90%（见下图D）。淋巴标志物IL-7r阳性细胞的占比超过60%（见下图E）。吉姆萨染色显示，已经有一部分细胞表现出了淋巴细胞特征(见下图F)    

在明确成分培养条件下诱导出的hPSC来源NK细胞表达NK细胞功能性受体

在HPCs向成熟NK细胞诱导期间(见下图A)，对NK细胞进行表型检测；培养至Day24的细胞被取出，检测CD56、CD161(NKR)、NKp44、KIR表型（见下图B）。在Day48，完成分化后，这些细胞会被收集检测CD94、CD159a、NKG2D 、NKp46、CD161（见下图B）。从表型来看，血清饲养环境下和无血清饲养条件下诱导出的NK细胞在表型上无明显差异。