成人外周血和脐带血 NK 细胞是有效 CAR 治疗 CD19 阳性白血病细胞的良好来源

研究摘要：
 

在血液系统癌症中，急性淋巴细胞白血病（ALL）和慢性淋巴细胞白血病（CLL）分别是儿童和老年人最常见的白血病。一些患者对化疗治疗没有反应，有必要用基于免疫疗法的治疗进行补充，例如嵌合抗原受体(CAR)治疗，这是针对这些癌症和B细胞淋巴瘤的最.新和更有效的治疗方法之一。尽管有希望得到完全缓解，但 CAR T细胞疗法仍然给患者带来一些风险，包括细胞因子释放综合征 (CRS) 和神经毒性。不同来源的 NK 细胞是 CAR 治疗的一种有前途的载体，因为它们在同种异体疗法中不会引起移植物抗宿主病 (GvHD)，并且它们会在没有事先致敏的情况下迅速攻击癌细胞。本文研究了来自成人外周血 (AB) 和脐带血(CB)的NK细胞对不同靶细胞的疗效，以确定 CAR 治疗的最佳来源。结果显示，AB CAR-NK 细胞在杀死 CD19 呈递靶细胞方面稍好一些，而CB NK细胞更容易刺激，而且它们在供体之间的数量更稳定。结果表明，两种来源的NK细胞都可作为CAR-NK治疗的最佳候选细胞。  
研究内容：
 

1、AB-NK细胞和CB-NK细胞可以通过T细胞设计的CD19 CAR成功转导

  在磁性细胞分离后通过负选择从AB或CB PBMC中分离出 NK 细胞，结果显示，从CB中分离得到的细胞多于从AB中分离得到的细胞（图 1a）。并且，在第一周，两个来源的NK细胞扩增相似；两周后在CB NK细胞中观察到略高的倍数扩增（图 1b ）。 转导后，细胞存活率都随着时间的推移而下降，直到第 28 天，两种细胞来源的存活率都显著下降到20%左右。然而，与两种细胞来源的模拟条件相比，CAR的存在不影响 AB NK细胞和CB NK细胞的存活率（图1c )。在转导效率方面，AB CAR-NK平均转导效率为47.46%，而CB CAR-NK 转导效率为 46.8%。AB和CB NK细胞的转导效率之间没有发现统计学差异（图 2 ）。通过对 CAR-NK细胞的培养以研究CAR表达随时间推移的稳定性。结果显示，CAR表达随时间从40%稳定地减少到20%（图 3 ）。
 

图1：NK细胞的分离、扩增与存活率

 

图2：两种来源NK细胞转导效率的比较

 

图3：转染后CAR表达的稳定性

 

2、两种来源的CD19-CAR-NK细胞在遇到表达CD19的细胞后引起脱粒

  本研究通过对细胞表面CD107a的表达来比较CD19-CAR-NK细胞与非转导（模拟）NK细胞对表达CD19细胞的脱粒能力。实验结果显示，转导或未转导CD19-CAR的AB和CB NK 细胞在K562存在下表现出类似的脱颗粒活性。一方面，当暴露于CD19阳性细胞时，AB CD19-CAR NK细胞比未转导的AB NK细胞表现出更高的脱粒（图 4a ）。CB CD19-CAR NK细胞比未转导的CB NK细胞表现出更高的脱粒（图 4b ）。在AB和CB NK细胞的脱粒之间没有发现显著差异（图 4c ）。

图4：两种来源的CD19-CAR-NK对CD19阳性表达细胞的脱粒能力比较

 

3、CD19-CAR转导的NK细胞在杀死表达CD19的细胞方面更有效

本研究测定了非转导和 CD19-CAR 转导的NK细胞在效应物：靶标不同比例下介导的细胞毒性活性。实验结果显示，转导和非转导NK细胞之间的靶细胞裂解没有差异。相比之下，AB和CB CD19-CAR NK 细胞比非转导NK细胞更好地裂解表达CD19的靶细胞，如 Nalm-6、ALL 细胞和 CLL 细胞。AB CD19-CAR NK细胞以10:1的比例杀死Nalm-6，以10:1和5:1的比例杀死ALL细胞，以1:1的比例杀死CLL细胞（图 5a ）。CB CD19-CAR NK 细胞在以 10:1 和 5:1 的比例裂解 CLL 细胞时明显更大（图 5b ）。 AB和CB CD19-CAR NK细胞杀伤能力的比较显示，除了在1：1比例裂解CLL外没有显著差异，其中AB CD19-CAR NK细胞显示出优异的裂解活性（图5c )。

图5：不同来源的CAR-NK细胞不同效靶比下对表达CD19细胞的裂解活性

 

总结：
  本研究显示，在脱粒方面，CAR-CD19 NK细胞比使用非转导NK细胞具有更好的杀伤力。AB CD19-CAR NK细胞和CB CD19-CAR NK细胞的脱粒活性没有显着差异，但AB CD19-CAR NK细胞在杀死表达CD19的靶细胞方面表现稍好。从 CB 细胞产生的NK细胞是这种疗法的良好候选者，因为它们显示出良好的杀伤活性，并且更容易扩增。总之，我们认为AB和CB NK细胞可能是CAR治疗的良好候选者。首先，AB NK 细胞对表达 CD19 的靶细胞的反应略好。其次，CB NK细胞提供更稳定的细胞数，它们可以被不同的白介素刺激，以增强体外扩增、杀伤活性和存活率。所以，这两种细胞来源的NK细胞都适用于CAR NK疗法中针对血液癌症的临床应用。  

参考文献：Herrera L, Santos S, Vesga MA, Anguita J, Martin-Ruiz I, Carrascosa T, Juan M, Eguizabal C. Adult peripheral blood and umbilical cord blood NK cells are good sources for effective CAR therapy against CD19 positive leukemic cells. Sci Rep. 2019 Dec 10;9(1):18729. doi: 10.1038/s41598-019-55239-y. PMID: 31822751; PMCID: PMC6904575.

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  来源：默赛尔生物研发部 主编：默赛尔生物研发部 E-mail：wechat@morecell.com.cn