来自工程多能干细胞的 CAR-NK 细胞：为所有患者提供现成的治疗方法

01、CAR-T 治疗的前景与挑战

过继细胞转移（ACT）用于治疗人类疾病在过去几年中进展迅速，特别是在癌症方面。嵌合抗原受体（CAR），人工设计，在免疫效应细胞表面表达，作为 GPS，将效应细胞重定向到其目标，如肿瘤，并彻底改变了 ACT 治疗领域。并且自体 CD19 CAR-T 细胞治疗血液系统恶性肿瘤，如慢性淋巴细胞白血病（CLL）、急性淋巴细胞白血病（ALL）和非霍奇金淋巴瘤（NHL）圆满成功。

而，CD19 CAR-T 治疗的成功并不是没有副作用的。CD19 CAR-T 细胞根除肿瘤导致多种炎症细胞因子的释放，包括 IL-6 和 TNF-α，这被称为细胞因子释放综合征（CRS）。因此将 CAR-T 治疗从 b 细胞恶性肿瘤转化为其他肿瘤（包括其他血液恶性肿瘤）仍然面临着几个需要解决的障碍：

1. 特异性

2. 耐药性/逃逸

3. 实体肿瘤

4. 制造

 

02、NK 细胞

【NK 细胞作为同种异体治疗药物】
NK 细胞的细胞毒性受激活和抑制受体平衡的调节，在激活配体存在和抑制受体信号缺失的情况下，激活抑制受体可以有效地杀死异常细胞。与 T 细胞不同，NK 细胞能够杀死缺失 MHC I 抗原「自身」标记物的细胞，而缺失 MHC I 标记物的有害细胞不能被 T 细胞检测和破坏。过继性 NK 细胞转移不需要严格的 HLA 匹配，而且缺乏导致 GvHD 的可能性，这是任何 T 细胞免疫治疗都面临的关键风险。因此，NK 细胞可以成为现成的异体治疗药物。
【CAR-NK 与 CAR-T】

与 T 细胞类似，NK 细胞被表面表达 CAR 来靶向特定抗原，特异性增强其自然细胞毒性。

表 1：

【挑战】1. 供体 NK 细胞的主要来源是外周血（PB）和 UCB，但其所含 NK 细胞数量极少。虽然体外指数扩张有/没有人工抗原提呈细胞（aAPC）从一个供者能够提供足够的细胞单一或一个数量有限的病人，剂量仍然是有限的单供体采血。2. 不同供体之间的功能和扩展差异增加了批次对批验证和制造延迟的负担，从而导致不一致的临床结果。3. 用病毒 CAR 构建物转染 NK 细胞与低水平或可变水平的转基因表达和对细胞活力的不利影响相关，限制了其他基因工程来提高 CAR-NK 细胞的疗效。4.24 种 NK 细胞系，如 NK9-2，已被追求用于临床应用。这些细胞本质上是癌变的，在注射给患者之前需要进行照射，这削弱了它们对癌症的杀伤能力。

 

03、来自 PSCs 的 CAR-NK

在分化的 PSC 培养中，已发现造血前体以及成熟的红系、髓系、巨噬细胞、巨核细胞和淋巴系。PSC-NK 细胞能够在细胞因子刺激下分泌 IFNγ，并对多种类型的癌细胞具有强大的自然细胞毒性，并在异种移植小鼠模型中显示出抗肿瘤活性。与 PB-NK 细胞相比，一些细胞组也成功地将 PSC 分化为表型相似的 NK 细胞，如 NK 相关受体表型和效应功能。

 

PSC 为 NK 细胞等基因工程细胞产物的生成提供了一个全新的途径。与基于供体的 CAR-NK 细胞相比，PSC-CAR-NK 有几个优势（表 1）

 

04、PSC-NK 细胞工业规模生产的 3D 平台
 

我们开发了一种新的 3d 生物反应器平台，可以有效地将人 PSCs 在单一生物反应器中连续转化为高纯度的 NK 细胞（图 1）。这种分化系统使用明确的无血清培养基, 并消除了任何饲养细胞的使用。首先，人类造血干细胞从 2D 单层培养适应于 3D 球体，并在生物反应器中扩大，然后 3D 造血干细胞球体被诱导为中胚层系分化，将 60-70% 的造血干细胞转化为血细胞。60-70% 的 PSCs 变成了造血内皮细胞祖细胞（CD31+ CD144+ CD34+）。然后将造血内皮细胞转换到造血和 NK 细胞分化条件下，持续长达 35-45 天。从大约第 15 天开始，NK 细胞从这些 3D 球中释放出来，并持续 4 周，并通过简单的离心收集释放出来的 NK 细胞（图 1）。释放的 PSC-NK 细胞表现出明显的同质形态，并表达了典型 NK 细胞特有的基因特征。收集到的细胞中超过 95% 表达 CD56，并激活 NKG2D、NKp44 和 NKp46 的受体（图 2）。这些 CD56+ PSC-NK 细胞不表达 TCR 和 CD3 的 T 细胞标记，也不表达 B 细胞标记 CD19；而超过 60% 的 CD56+ PSC-NK 细胞也表达 CD8α（图 2），而 PB CD56+NK 细胞的表达率为 30%,NK 细胞的增加与艾滋病患者的疾病消退有关。我们用 300 毫升的生物反应器可重复生成 1010 个纯 NK 细胞，并且这个过程已经在多个具有/不具有基因编辑或 CAR 的 hESC 和 iPSC 系中重复进行。

 

体外实验表明，生物反应器产生的 PSC-NK 细胞能够分泌 IFNγ，表达 CD107a（脱颗粒），并对白血病细胞、胰腺癌、卵巢癌、结直肠癌和肺癌等多种肿瘤细胞表现出强大的天然细胞毒性。我们还证明了 PSC-NK 细胞具有抗病毒活性，并特异性地杀死感染甲型流感、登革热、寨卡病毒和 HIV 病毒的正常细胞，但不杀死未感染的正常细胞。该 3D PSC-NK 制造平台使用定义的材料，不含血清或饲养细胞，可扩展和可重复用于生成同质功能 NK 细胞。随着永.久主 PSC-CAR 细胞系的建立，这种新型技术平台将为产生适合大量患者治疗的现成 CAR-NK 细胞提供取之不尽的细胞来源，从而使细胞免疫治疗领域发生革命性的变化。

图 1 在 3D 生物反应器中，多能干细胞（PSC）向造血内皮细胞（HE）、造血祖细胞和 NK 细胞的顺序分化。A，方案显示了用于 3D-PSC 分化为造血内皮、造血祖细胞和 NK 细胞的大约时间和逐步策略。B，不同阶段的形态学和特异性基因的表达。SLT，继发性淋巴组织。

 

图 2 iPS 细胞-NK 细胞分析。A，从未经纯化的 3d-生物反应器中收集的 iPS-NK 细胞的形态。B，iPS-NK 细胞具有代表性的正向和位点散射图。C-J，(C) CD56 (y) 和 TCR (x) 的 iPS-NK 细胞代表性流式细胞术图；(D) CD56(y) 和 CD3(x)；(E) CD19 (y) 和 PE 偶联抗体控制 (x)；(F) CD8(y) 和 CD4(x)；(G) CD56(y) 和 NKG2D (x)；(H) CD56(y) 和 NKp44(x)；(I) CD56(y) 和 NKp46(x) 和 (J) CD56(y) 和 KIR2DL1(y)1/DS1(x)

 

05、优化

从 PSCs 衍生的细胞产品的成功临床应用将需要 PSCs 向特定的细胞类型进行有效和可控的分化，并产生一个同质的细胞群。我们的 3D PSC-NK 技术提供了一个可扩展的、一致的、高效的和具有成本效益的制造平台，以产生同质的功能性 NK 细胞。如图 3 所示，GMP 级 PSC 系可在多能阶段进行基因操纵，以增强最终 NK 细胞产品的持久性和细胞毒性。基因编辑的 PSC 系可以进一步设计出针对不同癌症抗原和病毒抗原或自体活性 T 细胞的 CAR，以及针对自体活性 B 细胞的嵌合自体抗体受体（CAAR）。建立多个针对不同特定抗原的主 PSC-CAR 细胞库，将为制造真正异源的现成 CAR-NK 细胞提供取之不尽的细胞来源，可以在全球范围内迅速部署到癌症、感染和自身免疫性疾病患者。

图 3 基因工程 PSC-CAR-NK 细胞对癌症、病毒感染和自身免疫性疾病的治疗策略
 

未来的工作旨在开发更大的 (>5 L) 的生物反应器和物流，最终目标是使普通患者能够负担得起 CARNK 产品，并像传统药物一样容易处理。最终目标是使 CARNK 产品成为普通病人可以负担得起的产品，并且像传统药物一样容易处理。

 

来源：Lu SJ, Feng Q. CAR-NK cells from engineered pluripotent stem cells: Off-the-shelf therapeutics for all patients. Stem Cells Transl Med. 2021 Nov;10 Suppl 2(Suppl 2):S10-S17. doi: 10.1002/sctm.21-0135. PMID: 34724715; PMCID: PMC8560199.